Definicija biofilma U protekla dva desetljeća definicija biofilma neprestano se mijenjala. Biofilm je danas definiran kao  sesilna zajednica mikroorganizama čije su stanice ireverzibilno povezane sa supstratom i međusobno, te  uklopljene u izvanstanični matriks polisaharidnih polimera koji su same stvorile i adheriraju na inertnu ili živu  površinu,  a ispoljavaju izmijenjen fenotip uslijed promijenjene brzine razmnožavanja i transkripcije gena koje  ne uočavamo u planktonskih organizama. Na najjednostavniji način biofilm se može opisati kao skup bakterija  unutar gustog, sluzavog omotača građenog od šećera i proteina koji štiti bakterije od vanjskih utjecaja.  Struktura biofilma je vrlo kompleksna. Posjeduje kanale kojima cirkuliraju hranjivi produkti, stanice u  različitim dijelovima biofilma iskazuju različita svojstva i ekspresiju gena, pa se ta zajednica uspoređuje s  tkivima viših organizama. Radi se o heterogenim zajednicama koje se kontinuirano mijenjaju. Mogu sadržavati  samo jednu bakterijsku ili gljivičnu vrstu, a najčešće su polimikrobne, odnosno sadržavaju različite vrste  mikroorganizama.  Biofilm se vrlo često nalazi u kroničnim ranama i pretpostavlja se da kod pojedinih rana može biti jedan  od vodećih čimbenika odgođenog cijeljenja rane. Smatra se da je biofilm najvažniji čimbenik koji doprinosi  multiplim kroničnim inflamatornim promjenama. Istraživači američkog Centra za inženjering biofilma  Sveučilišta u Montani dokazali su prisutnost biofilma u 60 % kroničnih rana, za razliku od 6 % kod akutnih  rana. Pretpostavka je da skoro sve kronične rane sadrže biofilm u barem jednom dijelu rane.   Infekcija rane je, bez svake sumnje, najveći problem od svih mogućih komplikacija. Bilo da se radi o infekciji zatvorenih rana, ili otvorenih kroničnih rana, simptomi kod bolesnika mogu biti bol, oteklina i sekrecija, a također mogu biti rizik potencijalno smrtonosne sepse. Infekcija rane rezultat je neravnoteže između bolesnikovog imunološkog sustava, bakterija i lokalnih uvjeta u rani koji omogućuju proliferaciju bakterija. Kontakt:   tajnica - Dunja Hudoletnjak,    email: dhudolet@kbsd.hr     tel: 095-3777-175      fax: 01-3712-093 Nastanak i faze razvoja biofilma Da bi se uopće stvorio, bakterija mora imati sposobnost da adherira na površinu. Nemaju svi  mikroorganizma sposobnost stvaranja biofilma. Biofilm najčešće stvaraju slijedeći mikroorganizmi:  Staphylococcus spp., Streptococcus pyogenes, Candida spp., Enterobacteriaceae i Pseudomonas  aeruginosa. Osim vrste bakterija, također postoje i drugi čimbenici koji pogoduju nastanku biofilma u  kroničnoj rani. To su opće stanje organizma, imunološki status, ishemija tkiva ili nekroze, slaba prehrana  i komorbiditetni čimbenici  Sam proces stvaranja biofilma može se podijeliti u 5 faza.  U prvoj fazi nalaze se slobodni - planktonski mikroorganizmi koji se slobodno kreću u  ekstracelularnoj tekućini. U toj je fazi adheriranje mikroorganizama reverzibilno. U drugoj fazi dolazi do  ireverzibilnog adheriranja na površinu. Bakterije postaju čvrsto adherirane (sesilne) i započinje njihova  diferencijacija. Treću faza ili faza maturacije I karakterizira stvaranje ekstracelularnog matriksa i  povećanje broja kolonija. Jednom kada su čvrsto povezane, bakterije počinju stvarati matriks koji ih  okružuje poznat kao ekstracelularna polimerna substanca  - biofilm. Četvrta faza ili faza maturacija II  karakterizirana je rastom kolonija, i u toj fazi kolonije dosižu svoju maksimalnu veličinu. U koloniju se  prihvaćaju novi članovi, a oni mogu biti bakterije, gljive ili protozoe. Prihvaćene bakterije također  izlučuju ekstracelularni polisaharidni matriks, te se nastavlja stvaranje strukture koju nazivamo  biofilmom. Posljednja - 5. faza naziva se faza disperzije. Mikrokolonije mijenjaju svoj oblik u školjkasti,  dolazi do izlaska bakterija iz biofilma i rasipanja u potrazi za novim i boljim izvorom hranjivih tvari.  Prepoznavanje infekcije Infekcija se razvija kada je ravnoteža između domaćina, mikroba i okoline narušena. Čimbenici rizika za razvoj infekcije su brojni: komorbiditentne bolesti, vlažna okolina, imobilnost, zlouporaba primjene antibiotika, antiseptika i potpornih metoda liječenja, nedostatak vitamina (A,B,C,D,K), nedostatak minerala (cink, bakar, magnezij), lijekovi (kortikosteroidi, kemoterapeutici, antiflogistici), imunonekompentencija bilo koje etiologije, ishemija, hipoksija, hipotermija, pušenje, drogiranje, inkontinencija, itd. Prepoznavanje infekcije je klinička vještina koja je potpomognuta mikrobiološkim nalazom, ali se nikako ne može temeljiti samo na laboratorijskim nalazima. Klinički znakovi infekcije (lokalni eritem, lokalna bol, edem, celulitis i lokalno povišena temperatura) su elementarni znakovi infekcije. Naravno, što su rana i bolesnik kompleksniji, to je teže klinički postaviti dijagnozu infekcije. Cutting i Harding su 1994. godine formirali smjernice za identifikaciju infekcije rane. Uz već poznata 4 klasična klinička znaka infekcije utvrdili su slijedeće potencijalne znakove:pojačan eksudat koji može biti i gnojni, odgođeno cijeljenje rane, formiranje džepova rane, neočekivana pojava boli i osjetljivost bilo kod promjene obloga ili dok je obloga na rani, krhko granulacijsko tkivo, promjena boje dna rane i rubova rane, stvaranje abscesa. Infekcija kronične rane All wounds contain microorganisms, yet the majority are not infected. The spectrum of interactions between the microbial community and the host may gradually reach a point at which he wound healing process is impared or localised detrimental host effects are initiated. When this transition occurs, immediate intervention to pre-empt infection is indicated. Vowden and Cooper, 2006 Činjenica je da zapravo nema sterilne kronične rane, odnosno da se u svakoj kroničnoj rani nalaze određeni mikroorganizmi. Mikrobiološki dokaz postojanja mikroorganizama u kroničnoj rani nije automatski ekvivalent za infekciju. U ovisnosti od broja mikroorganizama, proliferacije i imunološkog odgovora domaćina, može se definirati pet kategorija mikrobiološkog statusa rane. To su: - Kontaminacija: prisutnost mikroorganizma na površini rane koji su fiksirani za tkivo bez znakova proliferacije. Kontaminacija nije uočljiva klinički i laboratorijski, ne izaziva imuni odgovor domaćina i  u toj je fazi apsolutno kontraindicirana primjena antimikrobne terapije. - Kolonizacija: prisutni su mikroorganizmi i postoji njihova proliferacija bez klinički signifikantne imunološke reakcije domaćina i bez kliničkih znakova infekcije. Također nema indikacije za antibiotsko liječenje. Indicirano je potporno liječenje – potporne obloge i antiseptici. Zloupotreba primjene antibiotika u toj fazi rane dovodi do prevalencije rezistentnih mikroba ili razmnožavanja patogenih, jer je osjetljiva fiziološka flora, koja je imala protektivnu  funkciju uklonjena. - Kritična kolonizacija: postoji signifikantna mikrobna proliferacija s prodorom bakterija u tkivo, ali bez postojanja klasičnih znakova infekcije. Postoji odgođeno cijeljenje rane zbog produkcije toksina. To je faza u kojoj bakterije počinju nadvladavati imuni odgovor domaćina. Razvoj kliničkih simptoma ovisi o vrsti dominantnog uzročnika, virulenciji, invazivnosti ili rezistenciji. U toj fazi u obzir dolazi i ciljana antibiotska terapija per os uz lokalnu primjenu potpornog liječenja i antiseptika. - Lokalna infekcija: klinički vidljiva; postoje tipični znaci – eritem (> 2 cm od rubova rane s tendencijom širenja može odgovarati ekvivalent širenja infekcije s rizikom generalizacije), oteklina, povišena lokalna temperatura okoline, bol, funkcionalni poremećaji, pojačana eksudacija, neugodan miris i stagnacija u cijeljenju. Uz lokalnu primjenu antiseptika indicirano je i ciljano antibiotsko liječenje. - Generalizirana infekcija: izraženi opći znakovi infekcije (povišena temperatura, leukocitoza, povišen CRP) Broj mikroorganizama u gramu tkiva (CFU – Colony Forming Unit) kod kroničnih rana ne može se uvijek sa sigurnošću primijeniti kao standard za kliničku rutinu i nije dostatan za povezivanje s određenom prethodno navedenom kategorijom. Uobičajeno je da se okvirno može govoriti o kontaminacija i kolonizaciji kada je broj bakterija ≤ 10⁴ CFU/g ili ml, kritičnoj kolonizaciji kada je broj bakterija 10⁵ CFU/g ili ml, i infekciji kada je broj bakterija ≥ 10⁶ CFU/g ili ml. Međutim nije samo broj bakterija kriterij koji definira da li postoji infekcija ili ne. Postoji više faktora koji utječu na konačan rezultat. To su, uz koncentraciju mikroorganizama i virulencija, rezistencija, vrsta i količina oštećenog tkiva, tip rane, strani materijali, osnovna bolest, specifična i nespecifična imunost domaćina, kao i čimbenici okoline. Beta hemolitički Streptokok može dovesti do destrukcije tkiva već pri koncentraciji od 10² CFU/g ili ml, a  Streptocoocus i Pseudomonas mogu prouzročiti infekciju već kod koncentracije od ≥10 ³ CFU/g ili ml. Osobitosti infekcija uzrokovanih biofilmom Infekcije uzrokovane biofilmom iskazuju određene kliničke značajke. Razvijaju se na inertnim površinama (mrtvome tkivu), perzistiraju na medicinskim implantatima i fragmentima mrtvog tkiva, kao što su sekvestri kostiju. Mogu biti uzrokovane samo jednom vrstom bakterija, mješavinom vrsta ili pak kombinacijom bakterija i gljiva. Sesilne bakterije oslobađaju antigene i stimuliraju proizvodnju antitijela, ali ta antitijela nisu ni protektivna ni učinkovita, jer ne ubijaju bakterije zaštićene u biofilmu. Naprotiv, mogu stvarati imunokompleks koji razara okolno tkivo. Imunosni odgovor domaćina nije dostatan da razori biofilm. Antibiotska terapija djeluje samo na planktonske stanice koje se oslobađaju iz biofilma, ali ne ubija stanice mikroorganizma u biofilmu. Zbog toga infekcije uzrokovane biofilmom tipično iskazuju povratne simptome, pa se javljaju rekurentne infekcije. Rane, osobito kronične, rezistentne su na liječenje. Bakterije koje žive u biofilmu 500 do 1000 puta su rezistentnije na antimikrobnu terapiju od  njihovih planktonskih oblika, pa prema tome koncentracija antibiotika koja bi uništila bakterije višestruko prelazi dozvoljene maksimalne doze. In vivo  antibiotska terapija suprimira simptome infekcije jer antibiotici djeluju samo na planktonske bakterije koje se odvajaju od biofilma, ali ne eradicira  bakterije unutar biofilma, pa prekidanje terapije rezultira rekurirajućom infekcijom, premda standardni mikrobiološki testovi pokazuju dobru osjetljivost  bakterija na antibiotik.  Slobodne se bakterije mogu ukloniti mehaničkim ispiranjem i primjenom fiziološke otopine, dok se bakterije u biofilmu mogu ukloniti samo  zajedno s otklanjanjem tkiva - debridementom bilo koje vrste, tako da se ukloni matriks na koji bakterije adheriraju..  Rezistenca biofilma na antibiotike Biofilm uvelike povećava rezistenciju, odnosno toleranciju mikroorganizama unutar biofilma, na imunološki odgovor domaćina, antibiotike i djelovanje okoline (antiseptike, manjak kisika i nutritivnih produkata). Obrambeni mehanizam biofilma rezultat je djelovanja multiplih mehanizama:  blokiranje - biofilm štiti bakterije prevenirajući difuziju - ulazak velikih molekula (antitijela i upalne stanice), kao i malih molekula  (antimikrobne supstance) unutar biofilma⁽¹⁷⁾  uzajamna zaštita - kooperativni zaštitni efekt različitih vrsta. Npr. bakterije rezistentne na antibiotik mogu izlučivati protektivne enzime ili  proteine koji će štititi susjedne nerezistentne bakterije u biofilmu⁽⁸⁾, kao i transferirati gene koji će stvoriti rezistenciju kod drugih bakterija, čak i  između različitih vrsta.⁽¹⁸⁾  hibernacija - bakterije mogu hibernirati. Stanice u biofilmu posjeduju ograničenu prehranu pa perzistiraju u sporo rastućem obliku - hibernaciji.  Budući da bakterije moraju biti metabolički aktivne da bi na njih djelovao antibiotik, hibernirane su bakterije u biofilmu neosjetljive na  antibiotike koji bi inače uništio aktivne bakterije.⁽⁸⁾    Međutim, usprkos spoznaji o rezistenciji bakterija na antibiotike u biofilmu, ipak je dokazanao da kombinacija makrolida (roksitromicin) i  karbapenema (imipenem) mogu djelovati na Staphylococcus  aureus i u biofilmu.  Antibiotici i antiseptici Uporaba antiseptika se dosad promatrala sa skepticizmom. Rezultati velikog broja in vitro studija ukazuje da antiseptici (kao npr. povidone jodine) ne djeluju citotoksično samo na bakterije već i na fibroblaste i ostale ljudske stanice odgovorne za cijeljenje rana. Međutim  in vivo studije nisu dokazale da utječu na odgođeno cijeljenje rana. Većina novih antiseptika (npr. Oktenisept) izgleda  da su relativno sigurni za uporabu i efikasni u prevenciji infekcije. Prednosti antiseptika mogu prevagnuti njihove nedostatke, te je potrebno ponovno preispitati stavove o uporabi antiseptika kod kroničnih rana. U svakom slučaju, kratkotrajna uporaba antiseptika (2 tjedna ili manje) može biti vrlo efikasna u smanjenju broja bakterija u rani. Vodikov peroksid (Hidrogen) treba izbjegavati budući da ima vrlo limitirana antimikrobna svojstva a citotoksičan je za fibroblaste, te je njegova uloga sada samo limitirana na kratkotrajnu uporabu kod gnojnih, inficiranih rana, dok je kod ostalih rana praktički kontraindicirana. Lokalni antiseptici dolaze u obzir kod kroničnih rana kod kojih je izražena bakterijska kolonizacija i kritična kolonizacija, odnosno lokalna infekcija. Isti se trebaju prestati upotrebljavati kada postanu vidljivi znaci progresije cijeljenja, odnosno poboljšanje lokalnog statusa. Ukoliko tijekom 2 tjedna uporabe antiseptika nema promjene u lokalnom statusu rane, preporuča se promjena lokalnog antiseptika. Ukoliko dolazi do pogoršanja stanja i do razvoja kliničkih znakova infekcije, indicirana je uporaba sistemskih antibiotika. Kod bolesnika s visokim rizikom ili kod imunokompromitiranih bolesnika (npr. dijabetičara), ili gdje postoji loša prokrvljenost koja može maskirati kardijalne znakove infekcije, u razmatranje dolazi uporaba sistemskih antibiotika. Odluka o uporabi istih prvenstveno ovisi o višegodišnjem iskustvu liječnika, a procjena se bazira na iskustvu i svakodnevnom praćenju i procjeni rane.  Ciljana antibiotska terapija određuje se prema mjestu i kliničkoj slici infekcije (težini), uzročniku i osjetljivosti na antibiotike, toksičnosti i indukciji rezistencije. U principu traje od 7 do 10 dana, iznimno duže (više tjedana). Antibiotici smanjuju broj bakterija, međutim postoje i problemi koji se javljaju kod njihove uporabe: • sistemski antibiotici djeluju na cijeli organizam, a ne samo na ranu. Zbog toga, oni mogu imati utjecaja na normalnu floru ranu i dovesti do poremećaja odnosa bakterija s posljedičnim razvojem drugih vrsta • sistemski antibiotici zahtijevaju adekvatnu prokrvljenost da bi mogli djelovati u rani, pa prema tome mogu biti neefikasni kod rana koje nemaju adekvatnu krvnu opskrbu (nekroze, arterijska insuficijencija) • razvoj rezistencije na antibiotike • bakterijska rezistencija smanjuje mogućnosti tretmana za sistemske infekcije • sistemski antibiotici ne djeluju na kolonije bakterije u biofilmu AUTOR:   Prim.dr.sc. Dubravko Huljev dr.med. specijalist opće kirurgije, subspecijalist traumatologije i plastične kirurgije KB Sveti Duh, Zagreb Klinika za kirurgiju Centar za plastičnu kirurgiju