Kontakt:   tajnica - Dunja Hudoletnjak,    email: dhudolet@kbsd.hr     tel: 095-3777-175      fax: 01-3712-093 OPĆENITO O UZORCIMA Bitni elementi pri uzimanju i postupanju s uzorcima su: 1. odabir ciljanog uzorka ovisno o lokalizaciji i karakteru lezije  2. način i tehnike uzimanja uzorka (dekontaminacija, kirurški, konzervativno)  3. vrijeme sakupljanja uzorka 4. količina i volumen uzorka (ml, gr )  5. proteklo vrijeme od časa uzimanja uzorka do primarnog uzgoja 1-2 sata (označiti sat, dan)  6. transport uzorka (sa ili bez podloge)  7. pohrana uzorka (termostat, hladionik, sobna temperatura) 8. prioritet uzorka (krv, likvor, rana)  9. parni ili komplementarni uzorci (obrisak endocerviksa + intrauterini uložak, urin + krv, bronhoalveolarni lavat + krv)  10. označavanje uzorka i potpis liječnika Relevantni podaci bitni za mikrobiološku obradu su: • osnovna dijagnoza bolesti • dijagnoza infekcije • primjena antibiotika, kortikosteroida, citostatika i koliko dugo Optimalno vrijeme uzimanja uzorka temeljeno je vrstom infekcije i mogućnostima laboratorija 1. dominantno tijekom dana 2. najveća koncentracija patogena u uzorku u jutarnjim satima, tada je i volumen uzorka najveći. Rezultat ovisi o volumenu (ml, gr) i broju uzoraka (1-  6 i više), jer se uzročnici izlučuju intermitentno i u malom broju 3. uzeti više vrsta kompatibilnih uzoraka ( urin + krv, bronhoalveolarni lavat + krv, obrisak + aspirat ili bioptat tkiva)istovremeno uzeti uzorak krvi za  biokemijsko određivanje markera upale (CRP, leukociti) 4. istovremeno uzeti uzorak krvi za biokemijsko određivanje markera upale (CRP, leukociti)  VRSTE UZORAKA Anatomsko područje i karakter lezije određuju vrstu uzorka, postupke uzimanja, dostavu i pohranu.  Razlikujemo:             Direktan uzorak: • vrste: krv, likvor, bioptat, aspirat iz organa i tkiva, svih vrsta tjelesnih tekućina, dubokih apscesa  • osobitost:fiziološki sterilno područje • patogen: nalazi se u sterilnom području, prisutan u malom broju izolat je uzročnik infekcije • postupci uzimanja: aseptični, nakon dekontaminacije površine, kirurški zahvat. aspiracija iglom • dostava: odmah, bez transportne podloge ili u specifičnoj podlozi (hemokultura) ili fiziološkoj otopini (tkivo) ili hranjivom bujonu (tkivo)  • pohrana: o sobna temperatura do 2 sata o termostat pri 37°C (u tekućoj podlozi) • obrada: odmah • rezultati:  o preliminarni (2-4 sata mikroskop) o konačni (24-72 sata; 5-10 dana uzgoj) Indirektni uzorak:  • vrste: ekspektorirani iskašljaj, (sputum), aspirat traheje, srednji mlaz urina. obrisak rane. obrisak endocerviksa, ždrijela • osobitost: patogen se nalazi u sterilnom području i do njega se dolazi kroz područje kolonizirano fiziološkom florom kože i/ili sluznice • patogen: uzorak sadrži patogen, ali i kolonizante- apatogenu fiziološki floru  • postupci uzimanja: stupanj kontaminacije uzorka fiziološkom florom ovisi o postupcima dekontaminacije, te uobičajenim ili posebnim tehnikama  uzimanja uzoraka  o sterilni instrumenti (bronhoskop) o priprema bolesnika (urin, rana) o dva obriska istovremeno (endocerviks) • dostava: odmah ili unutar 2 sata • pohrana: hladionik pri +4°C iznimno termostat ili sobna temperatura, uz uvjet da se nalazi u transportnoj podlozi  • obrada:             standardna              vrijeme trajanja obrade ovisi o vrsti mikroba vrsti uzorka određivanju osobitosti mikroba  Uzorak s fiziološkom florom:  • vrste: stolica, usna šupljina • osobitost: patogena i apatogena flora nalaze se na istome mjestu • postupci uzimanja: bitni su postupci uzimanja uzorka, da se smanji količina apatogena, tj. prisutne fiziološke flore • dostava: odmah ili tijekom 2 sata • pohrana: hladionik pri +4° C • obrada: selektivnim uzgojem dokazujemo patogene • rezultat: bitno navesti vrstu pretrage, ako se želi dokazati određeni patogen iz uzorka (npr. Toksin Clostridium difficile iz uzorka stolice)  OSOBITOSTI UZORAKA Općenito: Uzorak mora biti precizno obilježen i zaštićen u nepropusnom spremniku. Uz uzorak se šalje i pripadajuća uputnica s podacima bolesnika, osnovnoj  dijagnozi, dijagnozi infekcije, dosadašnjoj antimikrobnoj terapiji i vrsti tražene pretrage. Dan uzimanja uzorka je 0 dan obrade. Vrijeme potrebno za uzgoj  24-72 sata - 5 dana - 3 tjedna, ovisno o vrsti uzorka, pretrazi, mikrobu. Uzorci se obrađuju slojevito, a obrada se sastoji od: mikoskopskog preparata, za  kvantitativno i kvalitativno određivanje upalnih elemenata, uzgoja, kvantitativnog, ovisno o vrsti uzorka i kvalitativnog, ovisno o vrsti izolata sa  osobitostima, testa osjetljivosti i mišljenja. Jedan jedini uzorak je kao niti jedan. Nesigurne, irelevantne i nekorektne informacije slijede nakon nestručnog  uzimanja, pohrane i transporta uzoraka, što dovodi do zablude liječnika, a time i do nepravilne odluke.  TEHNIKE UZIMANJA UZORAKA Općenito: Za mikrobiološku obradu rana bitno je odrediti vrstu uzorka s obzirom na:  1. tip rane (kirurška incizija, traumatska, povreda, vrijed noge, kronična rana,dekubitus  2. mjesto rane 3. kliničke znakove infekcije  4. da li je primjenjena antimikrobna terapija, antiseptik, potporni ovoji ili neka druga vrsta potporne terapije (hiperbarična terapija kisikom, vacuum  potpomognuto cijeljenje rane i drugo) Bez obzira na vrstu lezije, prije uzimanja uzorka treba ukloniti površinsku mikrobnu floru, krastu, nekrozu, obilan eksudat. Lezija se ne može potpuno  obeskličiti, ali se ukupna količina mikroflore može smanjiti na 20%. (I.M. Miller,1999) POSTUPCI DEKONTAMINACIJE RANE 1. Mehaničko čišćenje fiziološkom otopinom - za ispiranje se koristi sterilna fiziološka otopina zagrijana na 37° C, ne starija od 24 sata, u količini od  30 ml. 2. Čišćenje se vrši pomoću igle i brizgaljke. Potisak mora biti jačine 4-15 PSI (Pounds Per Square Inch ili težina od 435,59 gr. na kvadrat veličine 2.54 cm), igla 19 gange, brizgaljka 35 mL, a vrh igle udaljen 2,5-5,0 cm od površine rane. Jačina mlaza može oštetiti tkivo i instalirati bakterije u njega ili  dispergirati mikrobe u okolinu. Čišćenje rane fiziološkom otopinom nema citostatski efekt na tkivo, ne dovodi do odloženog cijeljenja. Primjenjuje se u svim fazama cijeljenja, pri akutnim i kroničnim ranama, te nakon primjene antiseptika. 3. Dekontaminacija antiseptikom, ovisi o vrsti rane i fazi cijeljenja  4. Primjena antiseptika je ciljana, vremenski ograničena, a procjena individualna u odnosu na bolesnika. Jedina prava indikacija za primjenu  antiseptika je akutna faza akutna rane, do početka stvaranja granulacija. Sve ostale indikacije su dvojbena s obzirom na supresiju mikroflore,  citotoksično djelovanje na stanice domaćina, te odgođeno cijeljenje rane. Indikacije za primjenu antiseptika donose se u odnosu na individualnog  bolesnika i to kod: 1. inficirane akutne rane i prisutnog nekrotičnog tkiva  2.  akutne traumatske povrede  3. pri kroničnoj rani u dijabetičara i imunokompromitiranih neutropeničnih bolesnika 5. nakon dekontaminacije rane antisepticima, ranu treba isprati sterilnom, zagrijanom fiziološkom otopinom, kako bi se izbjeglo potencijalno  citotoksično djelovanje 6. Kirurški debridman ili debridman potpornim ovojima POSTUPCI UZIMANJA UZORAKA • Akutna površna incizija ili rana  o uzorak uzeti suhim ili u fiziološkoj otopini navlaženim brisom obrisati, ne prečvrsto, dno rane i /ili rubove rane, ostaviti otprilike 30 sekundi da  bris upije sadržaj rane o postupak ponoviti sa još jednim brisom o precizno naznačiti koji je prvi, a koji je drugi bris  o ako je prisutan sekret u rani, aspirirati sadržaj iglom i brizgaljkom > 1 ml o dostaviti u laboratorij unutar 1 - 2 sata po uzimanju u sterilnoj posudici ili brizgaljki  o pohrana sadržaja rane ili brisa u transportnoj podlozi moguća do 12 sati pri sobnoj temperaturi (22-25 C) • Akutna duboka (organ, organski prostor,incizija) rana, kronična rana, otvoreni absces, fistula  o eksudat iz lezije aspirirati iglom i brizgaljkom u količini > 1 ml o uzorak odmah zatvoriti „kapicom“ (bez igle) ili staviti u transportnu podlogu  o ne preporuča se postupak s dva brisa o uzorak tkiva se uzima „ punch“ biopsijom sa 3-4 mjesta ili kirurškom biopsijom s dva mjesta ( > 1gr tkiva) o bioptat se uzima na granici inficiranog i zdravog tkiva ili iz stijenke abscesa  o pri fistuli bitno dekontaminirati okolinu lezije, a zatim aspirirati sadržaj s dna lezije ili donje trećine lezije o transport unutar 1-2 sata po uzimanju u brizgaljki s „kapicom“ ili u sterilnoj posudici sa ili bez fiziološke otopine o transportnu podlogu sa sadržajem i ili tkivom može se pohraniti do 12 sati pri sobnoj temperaturi (22-25 C) • Zatvoreni absces: o uzorak je aspirat iz dubine dobiven punkcijom ili bioptat stjenke abscesa nakon kirurške incizije o uzimanje uzoraka, transport i pohrana identični su kao i kod otvorenog abscesa • Celulitis: o uzorak je aspirat koji se uzima iglom (18-25 gange) i brizgaljkom o nakon aspiracije sadržaja navući malo fiziološke otopine u iglu o sadržaj staviti u sterilnu epruvetu  o hitan transport tijekom 15 minuta, a očekivani izolat u 25-35% slučajeva  • Opekotine:  o prije uzimanja uzorka bioptata ili aspirata dekontaminirati ranu i učiniti kirurški debridman o uzeti bioptat s ruba lezije na granici granulacijskog i nekrotičnog tkiva  o odmah poslati u laboratorij, ako nije moguće, ostaviti na sobnoj temperaturi. • Dijelovi kosti i drugi intraoperativni uzorci:  o bioptate staviti u sterilnu posudu i odmah poslati u laboratorij o staviti u transportni bujon, odmah poslati u laboratorij, ako nije moguće ostaviti u termostat ili na sobnoj temperaturi. CILJANI UZORAK površna lezija  - tkivo, aspirat, dva brisa  duboka lezija - tkivo, aspirat  kronična rana - tkivo, aspirat  tlačni vrijed - tkivo, aspirat  zatvoreni absces  - aspirat, tkivo  otvoreni absces - aspirat, tkivo (stijenka abscesa) fistula - aspirat iz donje trećine fistule ili sa dna Obrisci su najlošiji izbor uzoraka, jer su mikrobi izloženi isušivanju i kisiku, pa se takav uzorak mora staviti u reduciranu, neselektivnu transportnu  podlogu. Anaerobne bakterije ugibaju eksponirane zraku, ali u miješanim uzgojima mogu preživjeti i dulje od 24 sata. Uzorke koje nije moguće  transportirati do laboratorija unutar 1 - 2 sata, treba pohraniti pri sobnoj temperaturi u tekućim transportnim podlogama. Povišena temperatura može  uzrokovati različiti rast nekih mikroba, pa čak i smrt, dok niže temprature mogu uzrokovati porast difuzije kisika. Uzorci rana obrađuju se kvantitativno i  kvalitativno, što znači da je moguće odrediti količinu mikroorganizama u rani i prisutnost invazivnih patogena. Pri odabiru obriska kao ciljanog uzorka,  rana se može u odnosu na ukupan broj uzročnika odrediti semikvantitativno pri čemu se izrazito gust porast bakterija izražava kao >105 CFU/ml.  Odabirom bioptata može se iskazati i kvantitativna količina mikroba što je značajno za interpretaciju izolata u odnosu na kolonizaciju, kritičnu kolonizaciju i  infekciju. Prisutna količina vitalnih mikroorganizama čimbenik je virulencije mikroba. Količina mikroba izražava se kao broj poraslih kolonija u mL ili gramu  uzorka. Zbog toga je važno uzeti određenu količinu uzorka, >1,0 gram tkiva ili > 1ml sadržaja.  NAJČEŠĆE POGREŠKE IZ KLINIČKE PRAKSE • Nedostatni ili loše popunjeni podaci • Najčešći uzorak je bris: o neadekvatan o nije ciljan o ne pohranjuje se adekvatno • Premala količina uzorka < 1 ml ili < 1 gr  • Pojedinačni uzorak • Rijetki komplementarni uzorci • Neadekvatno očitavanje strukturiranog nalaza  • Komunikacija ovisi o: o znanju o iInteresu o poznavanju kliničke problematike, obzirom na anamnezu, status, epidemiološke podatke o Nesporazumi: pitanje vremena, nalaza, konzultantskog mišljenja AUTOR:   Dr.sc. Nastja Kučišec Tepeš, prim.dr.med. Specijalist mikrobiolog